• <tr id='vwp7MX'><strong id='vwp7MX'></strong><small id='vwp7MX'></small><button id='vwp7MX'></button><li id='vwp7MX'><noscript id='vwp7MX'><big id='vwp7MX'></big><dt id='vwp7MX'></dt></noscript></li></tr><ol id='vwp7MX'><option id='vwp7MX'><table id='vwp7MX'><blockquote id='vwp7MX'><tbody id='vwp7MX'></tbody></blockquote></table></option></ol><u id='vwp7MX'></u><kbd id='vwp7MX'><kbd id='vwp7MX'></kbd></kbd>

    <code id='vwp7MX'><strong id='vwp7MX'></strong></code>

    <fieldset id='vwp7MX'></fieldset>
          <span id='vwp7MX'></span>

              <ins id='vwp7MX'></ins>
              <acronym id='vwp7MX'><em id='vwp7MX'></em><td id='vwp7MX'><div id='vwp7MX'></div></td></acronym><address id='vwp7MX'><big id='vwp7MX'><big id='vwp7MX'></big><legend id='vwp7MX'></legend></big></address>

              <i id='vwp7MX'><div id='vwp7MX'><ins id='vwp7MX'></ins></div></i>
              <i id='vwp7MX'></i>
            1. <dl id='vwp7MX'></dl>
              1. <blockquote id='vwp7MX'><q id='vwp7MX'><noscript id='vwp7MX'></noscript><dt id='vwp7MX'></dt></q></blockquote><noframes id='vwp7MX'><i id='vwp7MX'></i>

                人基因組/外顯子組

                Q1:FFPE 樣本為什麽不推薦使用全基因組測序?

                FFPE 樣本提取的 DNA 多數存在降解的情況,基因組呈現片段化,CNV/SV 等結構性變異檢出的假陽性率較高,無法體現全基因組測序在結構變異檢測方面的優勢,且通過增加測序深度提高變異檢出準確性的成本太高。

                Q2:癌癥基因組學測序為什麽通常選取同一個患者成對的癌組織和癌旁組織/血液樣本

                癌癥基因組學側重於研究彩73細胞特有的、非遺傳因素導致的體細胞突變,因此我們需要選取患者的正常組織進行測序,以過濾 germline mutations。由於考慮到個體間 germline 突變差異很大,為避免篩選出很多假陽性體細胞突變位點,彩73和正常組織需來源於同一個體。

                Q3:全基因組測序技術適用的研究方向有哪些?

                全基因組測序可以應用於孟德爾遺傳病研究、復雜疾病研究、罕見病研究、新生突變研究、藥物基因組研究、疾病分子分型研究、人群隊列數據庫構建及群體進化研究等。特別對於包括癌癥、精神分裂癥、智力障礙在內的復雜疾病,非編碼區變異及 CNV/SV 結構變異皆與疾病的發生具有密切的關系,全基因組測序可以結合非編碼區變異信息和結構變異信息全面挖掘致病突變位點。

                Q4:全基因組測序的測序深度如何選擇?

                測序深度根據研究目的、樣本量及預期而定。30×測序深度即可檢測絕大部分SNV,但如果研究目的是尋找癌組織中較大的結構變異、少數彩73細胞攜帶的豐度較低的突變,建議測序深度(一般)至少50×以上;群體重測序可以使用較低深度測序(~10×),用群體分析策略尋找相關變異。

                Q5:全基因組測序相對於全外顯子組測序的特點是什麽?

                全外顯子組測序捕獲基因組的外顯子區域,其基因組信息約占基因組大小的1.5%;全基因組測序對於全外顯子組來說,變異信息更全面。近些年非編碼區突變的研究越來越多,其可與多種癌癥在內的復雜疾病發生相關。

                Q6:如何尋找候選變異?

                尋找候選變異位點時,可利用變異註釋結果,關註非同義突變、剪接突變、移碼突變。a.去除千人基因組數據庫中 MAF >=1%的變異;b.去除 NHLBI-ESP6500 European American群體數據庫中 MAF >=1%的變異;c.去除 NHLBI-ESP6500 African American 群數據庫中MAF >=1%的變異;d.推測變異的致病性。利用 SIFT/PolyPhen2/Mutation assessor/Condel/FATHMM 進行打分,預測某個變異和氨基酸置換是否影響蛋白功能。如果score<=0.05 PolyPhen2>=0.909 MA score>=1.9 Condel = deleterious FATHMM=deleterious,就推測該變異可能是有害變異。

                Q7:突變位點為有效位點時使用的 depth 閾值是多少?

                call 變異時 SNP InDel 均要求 depth 大於等於 4

                Q8:數據中的 Duplicates 指什麽?如何定義?

                一般情況下,測序得到了兩對或兩對以上的 pair end reads 同時比對到參考序列上相同的 起始和結束位置,我們定義這種序列為 duplicates。在數據分析過程中,為了確保變異分析 的準確性,避免計算存儲資源的浪費,一般會通過生信的方法去掉 Duplicate reads 後再進行 下遊信息分析。

                Q9:如何驗證重測序的結果?

                通過全基因組重測序一般能夠發現 SNPInDelSVCNV 等多種遺傳變異,不同的變 異類型,其驗證方法也各不相同。SNPs 可以通過 PCR 擴增包含該 SNP 位點的區段,並測 序;或采用 SNP 分型檢測的方法驗證;b. 小片段的 InDel,可通過 PCR 擴增,利用 Sanger法測序進行驗證;c. CNVs 可通過 Real-time PCR 對存在拷貝數變異的片段進行擴增,並根 據 CT 值估算不同個體的拷貝數變化倍數;d. 小的 SVs 可通過 PCR 擴增和測序辨別,而大 的 SVs 則需要通過亞顯微方法發現,如 FISH 等。

                Q10:外顯子測序適用於什麽種類的研究?

                在人類基因中大約有 180,000 個外顯子,外顯子 CDS 區大小占人類基因組的 1~2%,約30 Mb。人類基因組的蛋白編碼區大約包含 85%的致病突變。外顯子組測序主要是針對編碼 區進行檢測,所以外顯子組測序主要適用於編碼區潛在變異引起的疾病研究。測序性價比高, 尤其適合高深度、大樣本量的測序,可找出常見突變及低頻突變。主要應用在孟德爾遺傳病 及彩73等復雜疾病的研究。

                Q11:外顯子測序可以檢測哪些類型的變異?

                外顯子捕獲是一個雜交捕獲的過程,不同外顯子區段的探針雜交效率並不完全相同,進而不同外顯子區段的覆蓋深度存在差異,因此通常外顯子測序不能用於 CNV 的檢測。

                Q12:外顯子測序為何強調“有效測序深度”,與“測序深度”的概念有何區別?

                有兩個概念需要明確,測序深度:測序得到的總堿基數與目標區域大小的比值;捕獲效率:比對到參考基因組中目標區域的數據量占比對到參考基因組上總數據量的比例。

                Q13:疾病基因組外顯子測序深度怎麽考慮?

                有研究表明,使用外顯子組測序,相比於常用的 50×有效測序深度,100×有效測序深度 下,功能性 SNPs ( coding SNPsmissense SNPs)和罕見變異(Rare SNPs, MAF<0.5%)的 檢出數量以及目標區域中 20×以上覆蓋深度堿基所占的比例,均達到一個很平穩的狀態,可 以得到最顯著、最可靠的變異檢出。

                Q14:FFPE 樣本和 ctDNA 研究適合用外顯子測序嗎?

                適合,FFPE 樣本和 ctDNA 由於樣本自身的特性,存在 DNA 片段化、起始量不足等情況,高深度的外顯子測序可以通過增加變異位點 reads 的支持數,提高變異檢出的準確性。

                Q15:癌組織為什麽要采用高深度測序?

                相對於遺傳病而言,彩73組織樣品中突變位點的等位基因頻率較低,一方面由於彩73細 胞在彩73組織中的占比偏低,另一方面則由於癌癥發展後期產生的突變僅存在於極少量的腫 瘤細胞中,采用高深度測序可以盡可能全面的檢測到與癌癥發生發展相關的變異。通常推薦 的外顯子測序深度為,癌組織大於 100x,癌旁組織/血液大於 50x

                Q16:一般用什麽方法來驗證 call SNP 準確率?

                Sanger 測序和芯片分型, Sanger 測序被認為是測序中的金標準

                動植物基因組變異檢測

                Q1:重測序都可以檢測哪些遺傳變異?

                重測序目前能夠檢測到的遺傳變異包括 SNP(single nucleotide polymorphism, 單核苷酸 多態性)、Indel(Insertion or deletion, 插入或缺失)、SV(structure variation, 結構變異)CNV(copy number variation, 拷貝數變異)等。

                Q2:動植物基因組重測序,一般變異檢測分析時參考基因組的 mapping 率要達到多少?

                一般建議 90%以上比較好,最低要求在 70%以上,比對上的 reads 才好進行分析,太低時數據有效利用率降低。

                Q3:二代測序檢測變異與芯片的比較?

                與傳統的分子標記和芯片相比,二代測序具有周期短、密度高、性價比高、檢測全面等 技術優勢。芯片只能檢測已知的 SNPCNV,而不能檢測 InDelSV,以及新變異或開發新 標記。

                Q4:變異檢測測序深度如何選擇?

                當測序深度為 5X 以上時,個體對基因組覆蓋度約 90%,能檢測到的個體 SNP 數約 60%。 當測序深度為 10X 以上時,個體對基因組覆蓋度約 95%,能檢測到的個體 SNP 數約 90%。 對較大群體進行 SNP 檢測時低深度數據可以進行缺失推斷以及個體間存在彌補效應,可提 高群體覆蓋度,因此建議測序深度不低於 5X;而當個體或群體較小時進行 SNP 檢測,建議 測序深度不低於 10X

                Q5:測序個體與參考基因組比對,比對率較低的原因有哪些?

                可能原因有:a. 受參考基因組(reference)組裝質量影響;b. 所測物種與參考基因組的 親緣關系較遠;c. 樣品的特殊前處理或者相對於參考基因組此樣品自身的變異太大,導致 比對率相對較低;d. 樣本存在外源汙染(如:植物中存在細菌汙染)。

                Q6:樣本量選擇多大合適?

                樣本量大小與樣本類型和研究目的相關。例如進行群體進化研究推薦 30 個樣本以上, 因為從統計學上說 30 個以上才屬於大樣本;對於進行基因挖掘的項目來說,無論是利用自 然群體進行 GWAS 分析或是用家系群體進行連鎖分析,都是群體越大越好,一般的情況下 進行 GWAS 分析的樣本推薦 300 個樣本以上,對於家系群體推薦 200 個以上。

                轉錄組測序

                Q1:如何確定研究物種有無參考基因組?

                根據所研究物種的拉丁文名,可在 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)Ensembl (http://asia.ensembl.org/index.html)JGI (http://genome.jgi-psf.org/) 中搜索是否有該物種的基 因組信息,也可在其他專門介紹某種物種的網站尋找參考基因組。

                Q2:是否一定要求設置生物學重復以及重復次數?

                目前沒有生物學重復的實驗可能發不了 SCI 文章,重復設置原則上越多越好,但是考慮 到現實條件,重復設置≥3。註:3 個生物學重復,不等同於將 3 個樣品的 RNA 等量混合後 測序。

                Q3:RNA 檢測結果的 RIN 值過低,對分析有什麽影響?

                一般來說,RIN 值過低說明 RNA 有部分降解,這可能導致:轉錄組組裝結果偏短,或者部分基因缺失;表達差異分析結果不可靠,差異表達結果被誇大。

                Q4: 真核核糖體 RNA 去除的話,去除率一般多高?

                去除真核生物 rRNA kit 主要是 Ribozero 公司的,針對物種特異。根據長期項目經驗, 絕大多數真核生物去除 rRNA 的效率大於 90%

                Q5:血液樣本送樣,有哪些註意事項?

                血液樣本采血建議使用 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑,可離心分離出白細胞、或全血加trizol 等方法進行處理,冷凍後,-80°C保存,幹冰運輸。

                Q6:彩73樣本準備時需要註意哪些事項?

                彩73樣本活性較高,RNA 在常溫條件下短時間內會幾乎全部降解。因此,建議樣本取 得後立即液氮速凍(要充分),-80°C保存,幹冰運輸。盡可能減少組織樣本在常溫空氣中 暴露時間,保證 RNA 的完整性。

                Q7:請幫助理解一下 RNA 測序中的 Duplicates?

                按照 illumina 平臺為例,普遍的 duplicates 比例大約在 10%左右。對於 RNA 來說,因為 難以區分是 PCR duplicates 還是 RNA 高表達形成的相同的模板,則無法去除 duplicates。從 而影響轉錄組表達量的準確性,尤其是小和中等表達量的轉錄本的準確性。

                Q8:RNA-Seq 推薦測序數據量與基因組大小有關嗎?

                RNA-Seq 推薦的測序數據量,主要與基因數量有關,不同物種基因組大小相差比較大, 但是編碼基因的數量相差並不大,一般物種在 3 萬左右。所以對於一般物種的 RNA-Seq 數 據量,10M clean reads 是足夠的。一般 HiSeq 平臺推薦 10M clean reads 數據量,為了更準確 全面的數據結果,也可以推薦 20M clean reads,所以現在一般都是 6G 數據。

                Q9:測序後有何驗證方法?

                實驗驗證的方法最常見的是通過實時熒光定量 PCR(qRT-PCR)技術來驗證測序結果。 還有 FISH(原位熒光雜交)、微陣列芯片技術、Northern blot 等。 功能驗證一般是基因敲 除、敲低或過表達,轉基因等。

                Q10:分析到的差異基因數目偏少,能否調整參數重新分析?

                首先確認所取樣品的時間點是否嚴格控制,明確是兩樣品間本身差異基因就少,還是其 他原因,確定無誤後方可適當調整“FDR <= 0.05 and | log2FC | >= 2”這一刪選顯著差異基 因的條件。

                Q11:如何從得到的眾多數據中篩選出自己感興趣的部分?

                拿到數據後,首先檢查測序質量有沒有問題,確定本次測序質量合格後可以先不忙看差 異表達分析的結果。因為可能差異基因數目太多,看起來眼花繚亂。建議直接查看 GO KEGG 功能富集部分,從其中挑選出自己研究感興趣的功能分類及代謝通路。對應的 excel列表中可以查看到有該功能對應的基因 ID,之後再去查看這些基因在不同樣品中的表達差 異。

                Q12:實驗設計是基於某種處理,希望找到調節相關代謝通路的基因,分析到的差異基因沒有 註釋到設定的代謝通路?

                因為 mRNA 表達具有時空特異性,所以在取樣設置的時候,一定嚴格控制在該通路起 作用階段。

                Q13:做植物研究時,KEGG 代謝通路富集到 human diease 以及 drug development 是為什麽?

                KEGG 本身是一個非常龐大的代謝通路網絡,某些人類疾病或者治療相關的基因,在有 些植物樣本中可能存在同源或者高度保守的區域,這樣在植物的研究中,可能會註釋到人類 相關的基因上。

                非編碼 RNA 測序

                Q1:Small RNA 分析需不需要參考基因組?

                需要,因為新 miRNA 的預測必須要通過其前體形成的二級結構進行分析,沒有參考基 因組,則無法知道其前體可能的二級結構。

                Q2:如何驗證 miRNA 的表達量?

                設計 miRNA 專門的發夾狀反轉錄引物,定量 PCR 驗證其表達量。

                Q3: Q:所有的物種 small RNA 都主要分布在 20-24 個堿基嗎?

                不是,這取決於物種和樣品特性,比如有些樣品就會在 30nt 左右表現出高豐度。

                Q4:小 RNA 測序對樣品提取有什麽特殊要求?

                提取總 RNA 時避免丟失小片段 RNA。如果直接提供 small RNA 樣品,可以使用 small RNA提取專用試劑盒來進行提取。

                Q5:為什麽小 RNA 的實驗結果中會存在降解的 mRNA 序列?

                由於 total RNA 常發生輕微的降解,而生物體內也有自然的降解過程,因此數據中就會 含有小部分 mRNA 降解片段。但通常這個比例很低,並且取決於樣品 total RNA 的質量。

                Q6:植物在 miRNA 預測中有什麽差別?

                植物 miRNA 可與 mRNA 的編碼區完全互補配對,並通過誘導 mRNA 降解而發揮抑制 表達的作用,我們可以直接通過比對來篩選靶基因。動物 miRNA 則可與 mRNA 3UTR區部分互補配對結合,進而抑制翻譯的進行,一般的,miRNA mRNA 的配對區域位於miRNA 5’端的 2-8 個堿基,稱為種子區,只要種子區能與 mRNA 互補配對即可發揮作 用,這也是一個 miNRA 能夠調控數百條 mRNA 的原因。

                Q7:lncRNA 研究適用於哪些研究方向?

                適用於醫學領域所有研究方向,主要是作為發現和鑒定與疾病的發生、診斷和治療相關 的生物標誌物。目前涉及最多的疾病是人體各大系統的癌癥,此外,還包括免疫、神經及腦、 骨骼、肝、肺等各組織的發育方面的研究。

                Q8:為什麽 lncRNA 要測鏈特異性文庫?

                測序過程中保存了 RNA 方向信息,一方面可以使基因表達定量更為準確;另一方面能夠準確區分轉錄本來自於基因組的哪條鏈,可以更好地鑒定 antisense lncRNA。

                Q9:lncRNA 測序與芯片方法對比有哪些優勢?

                與芯片方法相比可以增加 novel lncRNA 的預測。

                Q10:CircRNA 文庫構建的方法中,去除 rRNA 鏈特異性建庫,與去除 rRNA 線性消化鏈特 異性建庫的優缺點?

                a.去除 rRNA 鏈特異性建庫。優點:不需要使用 RNase R,減少實驗部分 RNA 損失,可 以同時研究 mRNA, lncRNA, circRNA;缺點:只能研究部分高表達的 circRNA,無法大規模 檢測 circRNA,需要較高的測序數據量,準確度差些;
                b.去除 rRNA 線性消化鏈特異性建庫。優點:circRNA 檢出量高, 是第一種方案的 20 倍,circRNA 鑒定準確度高;缺點:由於消除了線性 RNAmRNAlncRNA circRNA 表達水 平將會失真;

                c.LncRNA 數據(10 G clean data)鑒定到 1 千到 2 千個環狀 RNA,數量級在千位;而富集 方法可鑒定到 2W-3W 個環狀 RNA,數據量級在萬位;兩種方式可根據客戶研究目的和需求 進行針對性推薦,如客戶初期研究,可進行 lncRNA 建庫測序方法,具有較高性價比;如果 是針對性的研究環狀 RNA,可推薦環狀 RNA 標準建庫方法;

                Q11:哪些物種可以研究 lncRNA?

                lncRNA 分析,對物種有以下要求:a. 物種為真核生物;b. 物種具有參考基因組,至少拼接到 scaffold 水平;c. 具有較為完整的註釋。

                Q12:lncRNA 測序,構建文庫時為什麽要去除 rRNA?

                lncRNA 中只有 lincRNA 3’端帶有 polyA 結構,其他 lncRNA 沒有 polyA 結構,而rRNA 在總 RNA 中占比高達 80%左右,因此,為了不浪費測序數據量,獲得更全的 lncRNA信息,需要去除 rRNA

                Q13:lncRNA 靶基因預測是怎麽實現的?

                LncRNA 作為調控性 RNA,調控靶基因的方式主要有 co-location co-expressionco-location 靶基因預測基本原理認為 lncRNA 的功能與其坐標臨近的蛋白編碼基因相關,於是 將 lncRNA 臨近位置的(上下遊 100K)蛋白編碼基因篩出來作為其靶基因。co-expression靶基因預測基本原理認為 lncRNA 的功能不依賴於和編碼基因的位置關系,而和與其共表達 的蛋白編碼基因相關,可通過樣本間 lncRNA 與蛋白編碼基因的表達量相關性分析或共表達 分析方法來預測其靶基因。

                Q14:lncRNA 測序數據中 mRNA 的定量效果如何?

                用人的樣品作為標品,mRNA 定量與 qPCR 定量斯皮爾曼系數能夠達到 0.85

                Q15:lncRNA 如果需要進行驗證,如何進行引物設計?

                lncRNA 最短的長度是在 200nt,可滿足熒光定量 PCR(100-200nt 目的片段)的要求。 不過由於 lncRNA 的保守性比較低,組織特異性比較強,擴增效率比較低,可能需要設計多 對引物進行嘗試。

                Q16:想用 qPCR 做表達量的驗證,設計引物的時候要特別註意什麽?

                如果 lncRNA mRNA 有重疊,應在兩種序列特異的部分設計引物。

                Q17:circRNA 與 lncRNA 的結構和功能的差別是什麽?

                結構上:circRNA 沒有自由的 5’端和 3’端;功能上:circRNA 功能研究比較單一,現 在對於其是否能夠像 lncRNA 一樣在染色體水平、蛋白質水平上具有調控作用,尚未可知, 這些也是現在研究的方向。根據已有研究發現, circRNA 可以發揮海綿效應吸附 miRNA, 可以作為競爭性內源 RNA

                Q18:如何預測 circRNA?

                因為在 circRNA 純化收集的過程中,需要去除核糖體 RNA 和線性 RNA,然後打斷成片 段進行建庫測序。在得到測序結果後,需要對 circRNA 進行預測鑒定。由於 circRNA 頭尾 相接易環化,如果測序結果能獲得接頭序列(Jumping Sequence),便認為是 circRNA

                Q19:樣本間鑒定 circRNA 的差異大嗎?

                大。樣本均一化操作在 circRNA 中是錯誤的,因為 circRNA 不屬於上面所提到的“絕大部分基因”,這部分基因在均一化時我們認為幾乎沒有變化,因此它的含量存在較大變化。

                Q20:circRNA 需要做生物學重復嗎?

                需要。至少 3 個,越多越好。

                Q21:環狀 RNA 驗證方法?

                定量驗證:根據 junction 位點設計引物進行 qPCR 驗證;功能驗證:使用 circRIP 方法驗 證 miRNA Sponge 功能;使用 miRNA 敲除及拮抗等模擬物進行功能驗證。

                Q22:環狀 RNA(circRNA)是不是很穩定、不存在降解?

                CircRNA 為成環的 RNA 分子,其特性即是不易被 RNase R 降解。但是,實際上,降解 分兩種,一種是 RNase R 的降解,一種是水解。水解是不區分環狀或者非環狀的過程,並 且事實上環狀更容易被水解,因為環狀的堿基基團靠的近,羥基更容易去攻擊磷酸羥基鍵。 將 circRNA 放在室溫或者 60°C或者在鎂離子作用下,它們依然較容易被水解。

                全基因組甲基化(WGBS)

                Q1:全基因組甲基化(WGBS)的測序原理是什麽?

                全基因組甲基化測序的重要步驟是樣本的重亞硫酸鹽處理,可將所有未甲基化的 C(胞 嘧啶)轉化為 U(尿嘧啶),而已被甲基化的 C 則不受影響,在隨後的 PCR 反應中,U T(胸腺嘧啶)替代。因此,可根據 CT 的存在情況分析是否甲基化。

                Q2:全基因組甲基化的測序深度為多少?

                為了進行全基因組水平的甲基化分析,建議測序深度為物種基因組的大小的 30-50 倍。如果是有生物學重復的話,可以是 5-15X 測序深度。

                Q3:全基因組甲基化測序有哪些優勢?

                在全基因組水平,單堿基分辨率檢出甲基化位點,不僅能夠高精度發現 CpG 島等常見 區域的甲基化水平的變化,還能夠分析 gene body 區,基因間區等區域的甲基化水平的差異, 分析甲基化對染色體的狀態以及基因結構變化的影響,從多維度分析解決生物學問題。

                Q4:Bisulfite 的轉化率要求多少?

                要求 Bisulfite 轉化率達到 99%以上。如果樣品的 DNA 不存在不發生甲基化的 DNA 作 為對照,都會在樣品中混入 control DNA 來驗證 Bisulfite 的轉化率,一般用噬菌體 phix 文庫 作為對照。